Angew. Chem. Int. Ed.∣基于主客体相互作用调控蛋白质功能
大家好，给大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的工作，题为：A General Supramolecular Approach to Regulate Protein Functions by Cucurbit[7]uril and Unnatural Amino Acid Recognition。该工作的通讯作者是来自北京大学的刘涛教授。
精确控制蛋白质功能的分子在蛋白质功能研究与调控中具有重要意义。基于杯芳烃与蛋白质特定序列之间的主客体相互作用已被用于识别蛋白质表面并抑制其功能，然而该方法的普适性较低，探索出一种针对任何蛋白质并可逆调节其功能的通用的主客体分子识别方法将是有意义的。天然蛋白都是由20种天然氨基酸组成，只依靠这些有限的化学结构在蛋白质上实现高亲和力、高特异性的主客体分子识别具有挑战性。通过遗传密码扩展将人工合成的功能性非天然氨基酸编码到蛋白质中，有望克服这一困难。遗传密码扩展已被用于通过光调控的方式从单残基水平上精确调控蛋白质功能，尽管这些方法很有效，但对蛋白功能的调节并不可逆。作者认为将靠近蛋白质关键功能位点的残基替换为带有客体侧基的非天然氨基酸，可以使残基被主体分子识别，从而实现蛋白质功能的可逆控制（图1）。要实现这样的设计需要寻找能够保持蛋白质结构与活性，但同时具有较强主体结合能力的非天然氨基酸。4-叔丁基-L-苯丙氨酸（tBuF）是经典的客体分子，其结合能力远高于与其结构相似的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸。
图1. 基于主客体相互作用调控蛋白质活性示意图
作者利用TyrRS tRNACUA分子对获得了tBuF定点突变的绿色荧光蛋白，分子量为质谱所确认，表明此方法具有较高的插入效率，同时不会影响蛋白质的荧光活性。进一步的，作者选用了谷胱甘肽转移酶（GST）作为模型蛋白分子，通过GST与底物结合的单晶结构分析，作者分别选择了R108, K113与Q207等几处位于底物结合口袋入口处不同距离的位点进行点突变，高效获得了相应的突变蛋白质 (GST-R108tBuF, GST-K113tBuF与GSTQ207tBuF)。
图2. 谷胱甘肽转移酶（GST）活性可逆调控
作者发现几种突变蛋白与野生型蛋白具有相同的催化活性，并且加入CB[7]也不会降低野生型GST的催化活性，而对于三种蛋白质突变体，加入CB[7]之后，GST-R108tBuF与GSTQ207tBuF两种突变体的酶活性受到显著抑制，而GST-K113tBuF的酶活性则几乎不受影响，原因在于K113相比另两个突变点距离活性位点更远。作者也展示了加入竞争分子FGG，能够使GSTQ207tBuF的酶活性恢复至野生型GST水平，表明此种调控策略具有很好的可逆性（图2）。
图3. 酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)活性可逆调控
为了进一步证实这种抑制效应的确来源于主客体分子识别，作者利用等温滴定量热测量了CB[7]与蛋白突变体间的结合常数，GST-R108tBuF与GSTQ207tBuF的Kd分别为 24.2与4.45 mM，而野生型则没有结合。上述结果表明抑制效应来源于CB[7]与蛋白突变点tBuF间的识别与结合。
图4. 肿瘤坏死因子TNFα活性可逆调控
最后，为了验证该策略具有一定的普适性。作者展示了通过相似的策略也可以实现对于酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)活性的可逆调节（图3）。除了酶之外，作者还展示了该策略能够实现对细胞因子活性的可逆调控。肿瘤坏死因子TNFα是一种能够通过与肿瘤坏死因子受体（TNFR1）结合启动细胞凋亡程序的细胞因子，作者展示了能够通过将tBuF突变到其与TNFR1的结合区域，利用结合上的大位阻葫芦脲主体分子可逆的抑制其与细胞表面受体的结合，从而动态的开启和关闭细胞的凋亡过程（图4）。
总的来说，本工作中作者通过将一种与葫芦脲主体分子具有高亲和性的非天然氨基酸定点突变到蛋白质的活性区域附近，通过CB[7]分子与蛋白质的结合，实现了对其功能的可逆抑制与激活。该方法具有较高的普适性，对于不同酶以及细胞因子THFα活性的调控都具有良好效果。此外，该系统的组分具有良好的生物相容性，适用于活细胞当中，具有较高的生物学应用潜力。
作者：XW 审校：WGQ
Cao, W.; Qin, X.; Wang, Y.; Dai, Z.; Dai, X.; Wang, H., et al., A General Supramolecular Approach to Regulate Protein Functions by Cucurbit[7]uril and Unnatural Amino Acid Recognition. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60 (20), 11196-11200.
Link: https://www.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202100916